Metodo di misurazione dell'aflatossina nel mais
L'aflatossina, abbreviata in AFT in inglese, è un composto composto da un anello difuranico e cumarina (ossanaftochinone). Viene prodotta da ceppi come Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus, con un peso molecolare di 312-346 e un punto di fusione di 200-300 °C. Ha proprietà stabili e resistenti alle alte temperature e può produrre fluorescenza sotto luce ultravioletta a onde lunghe. È divisa in B1, B2, G1, G2, M1, M2, P1, R1, GM e alcoli tossici in base a diversi colori di fluorescenza, valori RF e strutture.
L'AFT è insolubile in acqua, etano, etere ed etere di petrolio, ma facilmente solubile in solventi organici come metanolo, etanolo, cloroformio, acetonitrile e dimetilformammide. L'AFT può decomporsi leggermente in solventi acidi con un pH di 1-3, decomporsi rapidamente e rompersi in soluzioni con un pH di 9-10, decomporsi rapidamente se esposta ad alcali e decomporsi in sali quasi non tossici in soluzioni alcaline con un pH di 9-10. Può essere ridotta in condizioni acide.
Obiettivo dell'esperimento
L'aflatossina si riferisce a sostanze altamente tossiche e cancerogene prodotte dai funghi. L'assunzione a breve termine di dosi elevate (1 mg/kg di peso corporeo) può causare avvelenamento acuto, sintomi comuni di disfunzione epatica come febbre, vomito, ittero o necrosi epatica. L'esposizione a lungo termine a basse dosi (20 microgrammi/kg di peso corporeo) può aumentare significativamente il rischio di cancro al fegato, cancro allo stomaco e altre malattie. Poiché è ampiamente presente nei raccolti e negli alimenti e rappresenta un grande pericolo per l'uomo e gli animali, l'istituzione di metodi di rilevamento rapidi e accurati è di grande importanza per garantire la sicurezza alimentare e la salute pubblica.
Lo scopo di questo esperimento è utilizzare il principio del saggio immunologico enzimatico a fase solida (ELISA), ovvero il saggio immunologico enzimatico (ELISA), per limitare e quantificare il contenuto di aflatossina B1 nei campioni, fornendo una base scientifica per la valutazione del rischio di contaminazione alimentare.
Apparecchiatura sperimentale
Analizzatore di micotossine ST-2000A
Mais, omogeneizzatore, dispositivo di essiccazione all'azoto, oscillatore, centrifuga, pipetta graduata, bilancia (sensibilità 0,01 g), micropipetta, metanolo, n-esano, reagente al cloroformio o al diclorometano
Procedura sperimentale
Controllare le attrezzature utilizzate nell'esperimento per garantire che siano pulite, asciutte e prive di contaminazione
Mescolare metanolo e acqua deionizzata in un rapporto di 7:3 per preparare la soluzione di estrazione del campione
Prendere 2 g di campione di mais frantumato e metterlo in una provetta da centrifuga da 50 ml. Aggiungere 5 ml di soluzione di estrazione del campione e agitare per 5 minuti a temperatura ambiente a 4000 giri/min per 10 minuti. Successivamente, prelevare 0,5 ml di surnatante e aggiungere 0,5 ml di acqua deionizzata. Mescolare bene
Rimuovere i reagenti necessari dall'ambiente refrigerato a 4 °C, lasciarli equilibrare a temperatura ambiente per 30 minuti e agitare bene. Estrarre il numero richiesto di piastre micro e telai, e diluire la soluzione di lavaggio concentrata 20 volte con acqua deionizzata per ottenere la soluzione di lavaggio di lavoro.
Numerare i micropori corrispondenti del campione e dello standard in sequenza, preparare 2 pozzetti paralleli per ogni campione e standard, e registrare le posizioni dei pozzetti standard e dei pozzetti campione. Aggiungere 50 µl/pozzetto di standard o campione nei rispettivi micropori, quindi aggiungere 50 µl/pozzetto di marcatore enzimatico, e quindi aggiungere 50 µl/pozzetto di soluzione di lavoro dell'anticorpo. Sigillare la piastra con una membrana di copertura, agitare delicatamente per 5 secondi e mescolare bene. Reagire a 25 °C per 30 minuti.
Rimuovere la pellicola di copertura, scuotere il liquido all'interno del pozzetto e lavarlo accuratamente 5 volte con 250 µl di detergente di lavoro per pozzetto, con un intervallo di 30 secondi tra ogni lavaggio. Utilizzare carta assorbente per asciugare
Aggiungere la soluzione substrato A (50 µl) a ciascun pozzetto, seguita dalla soluzione substrato B (50 µl). Agitare per 5 secondi e mescolare bene. Colorare a 25 °C al buio per 15 minuti.
Aggiungere 50 µl di soluzione di terminazione a ciascun pozzetto, agitare delicatamente e mescolare bene per terminare la reazione.
Misurare il valore di assorbanza di ciascun pozzetto a 450 nm utilizzando un analizzatore di aflatossine (si raccomanda una doppia lunghezza d'onda di 450/630 nm). La misurazione deve essere completata entro 10 minuti dalla terminazione della reazione
Lo strumento completa la misurazione e fornisce automaticamente il risultato
Risultati sperimentali
Dopo il test, il contenuto di aflatossina del campione è di circa 0,19 ug/kg, che soddisfa la norma GB 2761-2017 "Norma nazionale di sicurezza alimentare per i limiti di tossine fungine negli alimenti".